Fl-esperimenti ta 'PCR (reazzjoni fil-katina tal-polimerażi), l-imballaġġ jista' jidher sempliċi, iżda jolqot direttament l-istabbiltà tar-reaġent, il-faċilità ta 'użu, u riżultati affidabbli. Kemm jekk jaħżnu u jittrasportaw laboratorju - Reaġenti ppreparati jew premiċijiet kummerċjali, il-ħakma ta 'tekniki ta' ppakkjar PCR xierqa jistgħu jevitaw żbalji komuni u jtejbu l-effiċjenza sperimentali. Hawn taħt, naqsmu pariri prattiċi dwar l-għażla tal-materjal, strateġiji ta 'ppakkjar, u dettalji tal-ħażna.
I. Għażla tal-Materjal tal-Imballaġġ: Prijoritizzazzjoni tal-Kompatibilità u l-Protettività
Ir-reazzjonijiet tal-PCR huma sensittivi għat-temperatura, id-dawl, u l-kontaminanti, u għalhekk il-materjali tal-imballaġġ għandhom jissodisfaw tliet rekwiżiti ewlenin: airtightness, dawl - prova, u inertità kimika.
Għal tubi ta 'ċentrifuga u pjanċi PCR, il-polypropylene (PP) hija preferuta, minħabba t-trasparenza għolja tagħha u dNase / rNase - Proprjetajiet b'xejn . 0.2 ml irqiq - tubi PCR b'ħitan huma ideali għal trasferiment rapidu tas-sħana, filwaqt li t-tubi ta' 0.5 ML huma aħjar għall-ħażna għall-ħażna ta 'reagenti. Għal 96 - pjanċi tal-PCR sew, nirrakkomandaw li tagħżel disinn falda (għal faċilità ta 'manipulazzjoni robotika) jew disinn mhux imdendel (għall-konservazzjoni tal-ispazju).
Metodu tas-siġillar: Tubi ċentrifuga konvenzjonali jużaw tappijiet ċatti jew imqajma (biex jipprevjenu l-evaporazzjoni u t-tnixxif). Madankollu, għal żmien twil - ħażna fit-tul, Heat - film tas-siġillar (bħal parafilm) jew film li jieħu nifs minnu (bħal aeraseal) huwa rrakkomandat li jibbilanċja pressjoni interna u esterna. Pjanċi PCR huma rrakkomandati li jużaw sealers tal-fojl tal-aluminju li jwaħħlu (għolja - reżistenti għat-temperatura) jew self - film li jwaħħal (għal użu wieħed {-).
Protezzjoni tad-dawl: Reaġenti li fihom dawl - ingredjenti sensittivi (bħal ċerti żebgħat jew primer) għandhom ikunu mgeżwra fil-fojl tal-aluminju, jew pjanċi PCR iswed (disponibbli minn xi manifatturi) għandhom jintużaw.
II. Tekniki ta 'l-Alikwali: Imminimizza t-telf minn iffriżar ripetut - Ċikli ta' jinħall
Ir-reaġenti tal-alikwoti huma pass ewlieni fl-imballaġġ tal-PCR u jolqtu direttament ir-riproduċibilità sperimentali.
Alikwoġġ tat-Taħlita Master: Taħlitiet kaptan kummerċjali (bħal enzima TAQ u taħlita DNTP) huma rrakkomandati li jiġu alikwotati bbażati fuq il-volum ta 'reazzjoni flimkien ma' 5% - marġni ta '10% (eż., Għal reazzjoni ta' 20 μl, alikwot 22 μL għal kull tubu). Evita li tuża direttament minn imballaġġ bl-ingrossa, billi l-iffriżar ripetut - Iċ-ċikli ta 'jinħall jistgħu jwasslu għal tnaqqis fl-attività ta' enzimi (l-enzima TAQ tista 'titlef madwar 5% attività għal kull ċiklu ta' l-iffriżar).
Primers u Templates: Primers (speċjalment primer tad-dwana) huma rrakkomandati li jiġu alikwotati minn soluzzjonijiet ta 'stokk ta' 100 μm u maħżuna f '- 20 grad. Iddilwixxi għal konċentrazzjoni ta 'ħidma (ġeneralment 0.1-1 μm) qabel l-użu. Templates bħal DNA ġenomiku għandhom jiġu alikwotati f '- Uża kwantitajiet biex tevita kontaminazzjoni inkroċjata.
Għajnuniet għall-Prevenzjoni ta 'Kontaminazzjoni: Tiżgura li tubi ta' ċentrifuga huma niexfa qabel ma l-alikwozzjoni (l-etanol residwu jista 'jinibixxi PCR), pre - ponot tal-pipetta kessaħ biex jipprevjenu li r-reaġenti kesħin jeħlu mal-ħajt, u jilbsu ingwanti matul il-proċess kollu biex jiġu evitati kontaminazzjoni tad-DNA tal-ġilda.
Iii. Tikkettar u Żamma tar-Rekords: Evita n-nassa "Kaxxa s-Sewda"
It-tikkettar ċar huwa kruċjali għall-imballaġġ tal-PCR; It-tikkettar mhux korrett jista 'jeqred l-esperiment kollu.
Informazzjoni dwar it-tikkettar obbligatorju: Isem tar-Reaġent (eż., "2 × TAQ MasterMix"), Konċentrazzjoni / Kontenut (eż., "10 mm DNTPs"), numru tal-lott (għat-traċċabilità), kundizzjonijiet ta 'ħażna (eż., "-20 grad protett mid-dawl"), data ta' l-alikwot, u data ta 'skadenza (eż., "Uża fi żmien 6 xhur").
Tikkettar speċjali: Jekk ir-reaġent fih gliċerol (anti-konġelant), żebgħat (eż., SYBR aħdar), jew addittivi (eż., BSA), għandha tiġi pprovduta informazzjoni addizzjonali (eż., "Fih 50% gliċerol, ma taħżenx f'temperaturi għoljin").
Sinkronizzazzjoni tar-Rekord: Huwa rrakkomandat li tuża spreadsheet jew softwer ta 'ġestjoni tal-laboratorju (eż. Labguru) biex tirreġistra l-parametri dettaljati tal-kontenut ta' kull tubu (eż., Sekwenza tal-primer, valur TM) u tassoċjahom man-numru tat-tikketta fiżika.
Iv. Ħażna u Trasport: Temperatura tal-ibbilanċjar u protezzjoni fiżika
L-istabbiltà tar-reaġenti tal-PCR tiddependi ħafna fuq il-kundizzjonijiet tal-ħażna, u hija meħtieġa protezzjoni addizzjonali waqt it-trasport.
Ħażna Ġenerali:
Enzymes (TAQ, reverse transcriptase): Long - ħażna fit-terminu fi - 20 grad (evita ċikli ripetuti tal-iffriżar; alikwot u aħżen fi -80 grad għal użu futur);
Primers / Sondi: Aħżen fi -20 grad għal aktar minn sena (jekk ikun fih grupp modifikat bħal bijotina, tipproteġi mid-dawl);
Mhux - buffers tal-enżima (eż. PBS): qosra - ħażna fit-terminu f'4 grad (sa xahar sa 1).
Rekwiżiti tat-Trasport:
Għat-trasport tal-katina kiesħa, uża silġ niexef (- 78 grad) għal enzimi (miżmuma hawn taħt -20 grad), u silġ blu (madwar 0 grad) għal buffers għal trasport għal żmien qasir.
Evita vibrazzjoni eċċessiva (il-pjanċi PCR għandhom ikunu mwaħħlin f'kaxex tar-ragħwa biex tevita t-taħlit ta 'reaġenti bejn il-bjar).
Matul it-temperaturi għoljin tas-sajf, żid saff iżolanti mal-imballaġġ (eż. Borża tal-insulazzjoni tal-fojl tal-aluminju + pakkett tal-ġel iffriżat).
V. Problemi u Soluzzjonijiet Komuni
Problema 1: Preċipitazzjoni tar-reaġent (eż. Preċipitazzjoni ta 'DNTPs jew MGCL₂ f'temperaturi baxxi) → Soluzzjoni: Ċentrifuga fil-qosor (1000 rpm, 1 minuta) qabel l-alikwozzjoni. Ħoll f'inkubatur ta '37 grad qabel l-użu u l-vortiċi biex tħallat sewwa.
Problema 2: Siġill tal-Pjanċa faċilment jitqaxxar → Soluzzjoni: Agħżel is-Sħana - Sealer reżistenti b'appoġġ li jwaħħal, jew uża siġillatur tas-sħana (adattat għal esperimenti għoljin ta '- fluss).
Problema 3: Tikketti mċajpra → Soluzzjoni: Uża markatur li ma jgħaddix ilma minnu (bħal Sharpie) jew laser - tikketti tal-istampar biex ma jħallux kitba bil-idejn milli titħassar mill-alkoħol.
Konklużjoni
L-imballaġġ tal-PCR huwa aktar minn sempliċement reaġenti li "jippakkjaw"; Hija l-ewwel linja ta 'difiża għall-affidabbiltà sperimentali. Billi tagħżel materjali xierqa, l-istandardizzazzjoni tal-proċess ta 'l-alikwozzjoni, iżżomm it-tikkettar bir-reqqa, u żżomm kontroll strett tat-temperatura waqt it-trasport, tista' tnaqqas b'mod sinifikanti l-iżball uman, u tiżgura reazzjonijiet ta 'amplifikazzjoni sussegwenti aktar stabbli u riżultati aktar affidabbli. Ftakar: id-dettalji jiddeterminaw is-suċċess. Prattiki xierqa tal-imballaġġ tal-PCR jistgħu jiffrankaw is-soluzzjoni tal-problemi tal-ħin sinifikanti matul l-esperiment kollu tiegħek!